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Characterization of indorenate effects on brain monoamine metabolism
(1991) Benítez-King, Gloria; Antón-Tay, Fernando; Departmento de Neurofarmacología, Instituto Mexicano de Psiquiatría Mexico
Efecto de la melatonina sobre la actividad de la proteína cinasa C y la distribución de filamentos intermedios en las células N1E-115
(1995) Benítez-King, Gloria; Ríos, Amelia; Grimaldo, José Carlos; Antón-Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología, División de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría, Calz. México-Xochimilco 101 col. San Lorenzo Huipulco, 14370, México D.F.
En los años recientes hemos demostrado que uno de los mecanismos de acción de la melatonina (MEL), ocurre a nivel intracelular. La hormona se une a la calmodulina con alta afinidad (188 pM) en presencia de calcio y antagoniza su actividad. Recientemente hemos encontrado que la MEL además de antagonizar la actividad de la calmodulina, activa a la proteína cinasa C (PKC) in vitro y sinergiza la estimulación producida por esteres del forbol. Esta evidencia ha sugerido que la MEL además de unirse a la calmodulina in vivo, también podría unirse a la PKC modulando su actividad. La activación de la PKC citosólica, se acompaña de su traslado al citoesqueleto y a la membrana donde fosforila a la vimentina, causando el desensamble de los filamentos intermedios (IF) y modificando el soporte y la integración del espacio intracelular, así como la transducción de señales. En este trabajo se estudió el efecto de la MEL sobre la actividad de la PKC y la distribución de los IF de vimentina en las células NIE-115. Los resultados señalaron que en condiciones basales, el 99% de actividad de la enzima se encuentra en la fracción citosólica, y que en las células incubadas con MEL 1 nM durante 5-30 min y hasta 3 y 6 hrs, la mayor actividad se encuentra en la fracción citoesqueleto-membranal. Estos resultados sugieren que la hormona activa a la PKC y la traslada del citosol a la membrana y al citoesqueleto. También, por inmunofluorescencia de doble marcaje, se encontró que la MEL modificó la distribución subcelular de la PKC. En las células de neuroblastoma incubadas con 1 nM de la hormona, la enzima se detectó en estructuras filamentosas cortas, en tanto que en las células incubadas con el vehículo la PKC se encontró en estructuras filamentosas delgadas y con un patrón de fluorescencia difuso. Junto con los cambios en la distribución y la actividad de la PKC, se observó que la MEL modificó la estructura de los IF. En las celulas incubadas con la hormona, los IF de vimentina se observaron como estructuras filamentosas cortas, rectas y mucho menos densas que en las células incubadas con vehículo, en donde los IF se observaron como estructuras fibrosas onduladas poblando densamente al citoplasma y orientadas del núcleo a la periferia celular. Estos resultados indican que la MEL in vivo, además de unirse a la calmodulina es capaz de interaccionar con otras proteínas intracelulares con actividad funcional y corroboran que la hormona podría modular la actividad de sus células blanco a través de la fosforilación de proteínas. Los resultados también apoyan la hipótesis de que la MEL sincroniza la actividad celular con el fotoperiodo por medio de la modulación cíclica de la arquitectura celular.
Efecto de la melatonina sobre la actividad de la proteína cinasa C y la multiproteína cinasa II dependiente de calmodulina
(1994) Benítez-King, Gloria; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Martínez Hernández, Aída; Antón-Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología. división de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría. Calz. México-Xochimilco 101, San Lorenzo Huipulco, 14370 México.
La melatonina actúa como un regulador cronobiológico en los vertebrados, invertebrados y en el ser humano, sincronizando la actividad biológica del organismo con el ciclo luz-oscuridad. De ahí que se ha sugerido que la hormona tiene un papel importante en la fisiopatología de las enfermedades psiquiátricas que se presentan con alteraciones de los ritmos circadianos. En la actualidad, el conocimiento acerca del efecto modulador de la melatonina sobre la fisiología celular se encuentra en expansión, aun cuando la información sobre su mecanismo de acción es escasa. Hay evidencia que indica que la melatonina actúa a nivel celular por medio de varios mecanismos. Uno de ellos, propuesto por nuestro grupo, involucra la modulación intracelular de la actividad de la calmodulina por la melatonina. La calmodulina modula directa o indirectamente un amplio espectro de funciones celulares. En forma directa, activando enzimas tales como la fosfodiesterasa, la adenilato ciclasa, etc. e indirectamente, modulando la fosforilación de sustratos especificos al activar a la multiproteína cinasa II. Esta enzima fosforila una gran variedad de sustratos regulando funciones tales como el metabolismo de lípidos y carbihidratos, la sínteis y liberación de neurotransmisores, la funcionalidad del citoesqueleto, la homeostasis del calcio, y la expresión genética. En este trabajo se estudió el efecto de la melatonina sobre la actividad de la multiproteína cinasa II Ca2+-Calmodulina dependiente. Además, como se ha descrito que otros antagonistas de calmodulina (trifluoperazina y compuesto W-7) inhiben a la proteína cinasa C, se estudiaron los efectos de la hormona sobre la actividad de esta enzima. Los resultados obtenidos señalaron que las concentraciones fisiológicas de la melatonina inhiben la ctividad de la multiproteína cinasa II en un 40% (p < 0.01) y activan directamente a la proteína cinasa C (p < 0.007), en contraste con los antagonistas de la calmodulina (trifluoperazina y W-7), que inhiben la actividad de ambas enzimas. Estos datos confirman que la melatonina actúa como un antagonista de la calmodulina al inhibir la actividad de la multiproteína cinasa II y sugieren que la hormona es también capaz de unirse intracelularmente a otras proteínas funcionales, modulando su actividad. La melatonina podría sincronizar la actividad celular con el fotoperíodo por medio de una modulación selectiva de la fosforilación de proteínas y probablemente modula las respuestas desencadenadas por segundos mensajeros al actuar como un enlace de información cruzada entre dos caminos de traducción de señales, el del calcio y el del fosfatidil inositol.
Efecto de la melatonina sobre la concentración y la actividad de la calmodulina
(1990) Benítez-King, Gloria; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Sámano-Coronel, Lucía; Antón-Tay, Fernando; Depto. Neurofarmacología, División de Investigaciones Clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría. Calz. México-Xochimilco 101, Tlalpan, 14370, México, D.F.
La melatonina es una hormona secretada por la glándula pineal que sincroniza la actividad biológica del medio interno con el fotoperiodo. A la fecha se desconoce su mecanismo de acción a nivel molecular, sin embargo se ha sugerido que la hormona tiene efectos tanto citoplasmáticos como nucleares ya que modifica la estructuración del citoesqueleto microtubular y microfilamentoso en células en cultivo, inhibe la proliferación celular y es captada por el núcleo en las células blanco. Dado que la melatonina modifica varias actividades celulares que son reguladas por la calmodulina, en este trabajo se estudio: la union de melatonina a calmodulina; la modificación de la actividad de la fosfodiesterasa; y los efectos de la melatonina sobre la concentración de calmodulina y la incorporación de timidina-H3 en las células MDCK, 3T3 y N1E-115. Los resultados obtenidos muestran que la melatonina produce un incremento en la concentración de la calmodulina y la incorporación de timidina-H3 a los tres dias de cultivo y un decremento en estos parámetros a los seis dias de cultivo. Además, la melatonina inhibe la actividad de la fosfodiesterasa dependiente de calcio calmodulina con un IC50 de 1x10-9 M. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la melatonina regula la actividad celular a través de la modulación de calmodulina.
El efecto de la melatonina sobre la fosforilación de proteínas en una preparación de sinaptosomas del hipotálamo de la rata
(1998) Hernández, Ma. Eugenia; Galicia, Lourdes; Antón-Tay, Fernando; Benítez-King, Gloria; Instituto Mexicano de Psiquiatría, Depto. Neurofarmacología, DIC., México-Xochimilco 101, Col. San Lorenzo Huipulco, 14370, México, D.F.
Hay evidencias de que la melatonina podría participar en la patofisiología de algunas enfermedades mentales. Esta hormona modifica la síntesis y liberación de neurotransmisores en el sistema nervioso central. La fosforilación de proteínas desempeña un papel crucial en la fisiología neuronal. En particular, la fosforilación de la sinapsina I por la cinasa II dependiente de calmodulina, modula el transporte de las vesículas y la liberación de los neurotransmisores en la terminal sináptica. Recientemente se describió que la melatonina in vitro inhibe la actividad y la autofosforilación de la cinasa II dependiente de la calmodulina. Como una primera etapa para entender el mecanismo por medio del cual la melatonina modula la liberación de neurotransmisores, en este trabajo se estudiaron los efectos de la hormona sobre la fosforilación de proteínas en una preparación de sinaptosomas obtenidos del hipotálamo de la rata. Los resultados señalaron que los sinaptosomas despolarizados con concentraciones altas de potasio liberaron 3H-GABA y aumentaron la fosforilación de las proteínas en un 50 %. La melatonina (1 nM) inhibió la fosforilación de las proteínas de peso molecular de 50,54,58-60 y 87 kd en sinaptosomas basales (30 %) y despolarizados con concentraciones altas de potasio (50 %). Los resultados sugieren que la hormona, al actuar como un antagonista de calmodulina e inhibir la fosforilación de proteínas, puede modular la liberación de neurotransmisores.
Efecto de la melatonina sobre la unión del [3H]-dibutirato de forbol a la proteína cinasa C
(1997) Benítez-King, Gloria; Ramírez Rodríguez, Gerardo; Martínez Mateos, Isabel; Hernández Gutiérrez, María Eugenia; Antón-Tay, Fernando; Instituto Mexicano de Psiquiatría, Departamento de Neurofarmacología, DIC. Calz. México-Xochimilco 101, San Lorenzo Huipulco, 14370, México, D.F.
La melatonina es una hormona lipofílica que actúa como un neuromodulador en el sistema nervioso central. Existen evidencias que sugieren que esta hormona podría participar en la patofisiología de algunas enfermedades psiquiátricas. Sin embargo, no se conoce con precisión como participa en la etiología de estas enfermedades. De ahí que el estudio de su mecanismo de acción, así como las respuestas celulares que causa, sea una estrategia clave para poder entender el papel que tiene la psiquiatría, y su posible utilidad terapéutica. En los últimos años, se ha descrito que la señal de melatonina es decodificada por sus células blanco mediante varios mecanismos: por la unión a receptores membranales específicos a proteínas intracelulares. Una de las proteínas que decodifica la señal de la melatonina, es la calmodulina. La melatonina se une a la calmodulina con alta afinidad y antagoniza su actividad, modulando así, la señal del Ca++. Recientemente se ha descrito que la melatonina activa a la proteína cinasa C, tanto in vivo como in vitro. Esta enzima se activa por el diacilglicerol y los ésteres del forbol en presencia de la fosfatidilserina. Una vez activa, la enzima fosforila une gran variedad de sustratos claves para la fisiología celular. Además de activar la proteína cinasa C, la melatonina sinergiza la activación y la autofosforilación de la enzima causada por el miristato de forbol. Estos resultados, han sugerido que la hormona podría unirse a la proteína cinasa C, y así modular la respuesta de la enzima a los ésteres del forbol. En este trabajo se estudió el efecto de la melatonina sobre la unión del [3H]-dibutirato 12, 13 de forbol a la proteína cinasa C y se determinó , si el efecto es dependiente de Ca++. Los ensayos de unión se realizaron con el método de ultrafiltración rápida. Como fuente de proteína cinasa C, se utilizó una fracción cruda de cerebro de rata, obtenida a 100 000 x g o de células MDCK. Los resultados obtenidos señalaron que la melatonina (10-9M) aumentó en un 50 % la unión del [3H]-dibutirato 12, 13 de forbol a la proteína cinasa C, solamente en presencia de Ca++. Con concentraciones mayores (10-7-10-5 M) la hormona aumentó la unión del éster del forbol hasta en un 75 %. El efecto de la melatonina sobre la unión del [3H]-dibutirato 12, 13 de forbol en la enzima fue específico, ya que el catabolito de la hormona, la 6-hidroximelatonina y sus precursores, la N-acetilserotonina y la serotonina no incrementaron significativamente la unión del éster del forbol a la proteína cinasa C en un margen de concentraciones de 10-11 a 10-5 M. El incremento en la unión del [3H]-dibutirato 12, 13 de forbol a la proteína cinasa C causado por la melatonina, se observó también en presencia de la fosfatidilserina y con la enzima obtenida de las células epiteliales MDCK. Los resultados apoyan la hipótesis de que la melatonina se une a la proteína cinasa C. Además sugieren, que la hormona podría amplificar la respuesta de los receptores acoplados a la vía del fosfatidilinositol, aumentando así la unión de los activadores de la proteína cinasa C a las isoformas de la enzima, que son dependientes de Ca++.
In vitro inhibition of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II activity by melatonin
(1996) Benítez-King, Gloria; Ríos, Amelia; Martínez, Aída; Antón-Tay, Fernando; Instituto Mexicano de Psiquiatría, Departamento de Neurofarmacología, Mexico City, Mexico
In Vitro Stimulation of Protein Kinase C by Melatonin
(1998) Antón-Tay, Fernando; Ramírez, Gerardo; Martínez, Isabel; Benítez-King, Gloria; Universidad Autonoma Metropolitana - Iztapalapa, Dpto. de Biología de la Reproducción CBS.; fat@xanum.uam.mx
It has been shown that melatonin through binding to calmodulin acts both in vitro and in vivo as a potent calmodulin antagonist. It is known that calmodulin antagonists both bind to the hydrophobic domain of Ca2+ activated calmodulin, and inhibit protein kinase C activity. In this work we explored the effects of melatonin on Ca2+ dependent protein kinase C activity in vitro using both a pure commercial rat brain protein kinase C, and a partially purified enzyme from MDCK and N1E-115 cell homogenates. The results showed that melatonin directly activated protein kinase C with a half stimulatory concentration of 1 nM. In addition the hormone augmented by 30% the phorbol ester stimulated protein kinase C activity and increased [3H] PDBu binding to the kinase. In contrast, calmodulin antagonists (500 _M) and protein kinase C inhibitors (100 _M) abolished the enzyme activity. Melatonin analogs tested were ineffective in increasing either protein kinase C activity or [3H] PDBu binding. Moreover, the hormone stimulated protein kinase C autophosphorylation directly and in the presence of phorbol ester and phosphatidylserine. The results show that besides the melatonin binding to calmodulin, the hormone also interacts with protein kinase C only in the presence of Ca2+. They also suggest that the melatonin mechanism of action may involve interactions with other intracellular hydrophobic and Ca2+ dependent proteins.
La melatonina es un modulador de la arquitectura celular
(1988) Benítez-King, Gloria; Huerto-Delgadillo, Lourdes; Villarreal, María Luisa; Antón-Tay, Fernando; Departamento de Neurofarmacología, División de Investigaciones clínicas, Instituto Mexicano de Psiquiatría. Calz. México-Xochimilco 101, Tlalpan 14370, México, D.F.
Los efectos de la melatonina desde el punto de vista fisiológico estan bien documentados, sin embargo, las acciones de la hormona a nivel subcelular se desconocen hasta la fecha. Hay evidencia que sugiere que la melatonina tiene efectos tanto citoplasmáticos como nucleares. Entre sus efectos en el citoplasma se ha sugerido indirectamente que la melatonina afecta al citoesqueleto. Este organelo celular participa en el mantenimiento de la morfología y la formación de acúmulos de agua (domos) en una línea celular derivada del riñon (MDCK). En este trabajo se estudió la acción que ejerce la melatonina sobre el citoesqueleto, medida como los cambios en la morfología y formación de domos en las células MDCK. Estas células se incubaron con 10-11, 10-9, 10-7, y 10-5 M de melatonina. Después de dos días de incubación, las células MDCK emitieron prolongaciones citoplasmáticas cortas que a los 4 días de cultivo se hicieron más largas hasta tocar a las células vecinas. Los análogos estructurales de la melatonina N-acetilserotonina, 6-OH melatonina y serotonina, no indujeron éstos cambios. Las células MDCK, sembradas a alta densidad y cultivadas a confluencia durante 6 y 12 días, formaron una mayor cantidad de domos. Los análogos de la melatonina a concentraciones de 10-9 y 10-11M no mostraron éste efecto. Se demostró además, en este trabajo, que los microfilamentos de actina en las células tratadas con la melatonina durante 4 días, tienen una distribución diferente al de las células controles. Nuestros resultados sugieren que la melatonina modifica el citoesqueleto de las células MDCK. Esta modificación se ve traducida en cambios en la morfología de las células y en un incremento en la formación de domos.